Curva de crecimiento en microorganismos.
Fases del crecimiento de un cultivo En este apartado vamos a revisar el estudio de la cinética del crecimiento de microorganismos que crecen en un cultivo realizado en un volumen finito. a esto se le denomina cultivo batch y podríamos traducirlo por cultivo discontinuo por contraposición con el cultivo continuo que desarrollaremos más adelante. El desarrollo de un cultivo discontinuo se ajusta al representado en la siguiente figura:
Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo: la fase lag en la que el microorganismo se adapta a las nuevas condiciones y pone en marcha su maquinaria metabólica para poder crecer activamente. La duración de esta fase es variable y en general es mayor cuanto más grande sea el cambio en las condiciones en las que se encuentra el microorganismo. (2) La fase exponencial cuya cinética explicamos en la página anterior. (3) La fase estacionaria en la que no hay aumento neto de microorganismos, lo que no significa que no se dividan algunos, si no que la aparición de nuevos individuos se compensa por la muerte de otros. (4) La fase de muerte en la que el número de microorganismos vivos disminuye de forma exponencial con una constante k que depende de diferentes circunstancias.
En la fase de muerte decimos que el número de microorganismos vivos disminuye exponencialmente. Pero ¿qué es un microorganismo vivo en términos microbiológicos?. Consideramos vivo al microorganismo que puede multiplicarse (dividirse), y muerto al que ha perdido irreversiblemente la capacidad de dividirse. Es importante entender este concepto porque los microorganismos microbiológicamente muertos no tienen porqué estar metabólicamente inactivos. Medida del crecimiento microbiano Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo diferentes parámetros algunos de los cuales presentaré a continuación. No debemos olvidar que en condiciones de crecimiento equilibrado todos los parámetros del cultivo evolucionan de forma proporcional y, por consiguiente, midiendo uno de ellos (el de medida más fácil) podemos medir el resto. En este apartado revisaremos los principales métodos de recuento de microorganismos. Una información más completa puede encontrarse en la conexión Métodos de recuento. Los métodos para el seguimiento de la evolución de un cultivo microbiano pueden clasificarse en directos e indirectos. Los métodos directos se basan en la medida de la evolución del número de células vivas (técnicas de plaqueo) o del número de partículas (técnicas microscópicas y de contadores de partículas). Los métodos indirectos se basan en la medida de algún parámetro del cultivo que nos permite deducir información sobre la evolución del número de microorganismos. La elección de un método de seguimiento del cultivo en concreto depende de las características del cultivo y del proceso. Entre los métodos principales de recuento de microorganismos podemos destacar: 1.- Las técnicas de recuento microscópico de células sin fijar usando microscopía de contraste de fae. Para ello se cuenta el número de partículas en un volumen determinado usando una célula de Petroff-Hauser o de Neubauer (portaobjetos modificado en e que una rejilla nos permite conocer el volumen que estamos observando). El procedimiento es rápido y sencillo; pero no permite distinguir células vivas inmóviles de células muertas. 2.- Contaje de partículas utilizando sistemas automáticos del tipo Coulter Counter. La operación de estos sistemas es sencilla (método de empleo) y permite rápidamente determinar el número de partículas presentes en una suspensión y la distribución de sus tamaños. El problema es que no distingue entre células vivas y muertas ni entre células y agregados de material insoluble presente en la suspensión del cultivo. 3.- Técnicas de recuento en placa, basadas en colocar en un medio de cultivo adecuado un volumen determinado de muestra. Cada una de las células aisladas dará lugar, después de la incubación correspondiente, a una colonia de forma que el número de estas nos permitirá estimar el número de células presentes en la muestra plaqueada (sembrada). El sistema es fácil de utilizar en el caso de células aisladas (no sirve en el caso de hongos filamentosos, por ejemplo). Puede realizarse sembrando en superficie (extendiendo un volumen dado de muestra sobre el medio de cultivo sólido) o en profundidad (mezclando un volumen dado de muestra con el medio de cultivo antes que solidifique). Esta última opción permite realizar el recuento de microorganismos microaerófilos que no crecen bien en la superficie de las placas de cultivo. Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadística, es necesario contar entre 30 y 300 colonias con objeto de disminuir el error de la medida. 4. Técnicas turbidométricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las partículas en suspensión (células) y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un equipo similar al que se emplea en la medida de la absorbancia de luz por disoluciones coloreadas (colorímetro, por ejemplo). Las medidas se hacen a una longitud de onda adecuada (normalmente en el entorno de 550 nm) y los valores se suelen denominar valores de densidad óptica. La limitación de este sistema, por otra parte muy sencillo, es que no distingue células vivas de muerta y que normalmente no es capaz de detectar densidades celulares menores a 10.000 células por mililitro. 5.- Medida de peso seco. El sistema consiste en la filtración del cultivo a través de una membrana que retenga las células y su posterior desecación hasta peso constante. El sistema, obviamente, no diferencía células vivas de muertas y su sensibilidad es limitada. 6.- Medida del ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisión de luz por la luciferasa de luciérnaga (Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. De esta forma se puede medir la concentración de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta medida es interesante porque la concentración de ATP decae rápidamente en las células muertas, de forma que esa medida indirecta detecta únicamente las células vivas. Los sistemas de medida del crecimiento celular se han adaptado técnicamente para poder ser utilizados como sistemas online. En una operación on line no es necesario extraer la muestra del cultivo para realizar la medida. Esto es muy importante en el caso de fermentaciones en gran volumen porque permite realizar medidas en tiempo real y disminuye los riesgos de contaminación. Antes de cerrar este apartado hay que señalar que en la naturaleza hay muchísimos más microorganismos de los que podemos detectar por la mayoría de los sistemas de recuento. De hecho, se estima que en el suelo o en el agua podemos cultivar únicamente proporciones menores al 1% de los microorganismos vivos. Esto es debido a varias causas entre las que se cuenta la falta de medios de cultivo adecuado, la dependencia de otros microorganismos para el cultivo debido a procesos de sintrofía y la oligotrofia (inhibición por altas concentraciones de nutrientes) que muestran algunos microorganismos.
Fuente: Grupo de Investigación de Genética y Microbiología GENMIC Genetics and Microbiology Research Group
